Molecular diversity and transferability of integrons from wastewaters

Na evolução bacteriana, a capacidade de explorar novos ambientes e de responder a diferentes pressões selectivas deve-se principalmente à aquisição de novos genes por transferência horizontal. Integrões são elementos genéticos bacterianos que constituem sistemas naturais de captura e expressão de cassetes de genes, sendo um dos principais mecanismos bacterianos envolvidos na aquisição de resistências a antibióticos. Estudos recentes suportam a hipótese de que os ambientes naturais constituem importantes reservatórios de integrões e cassetes de genes. Uma vez que as águas residuais são descarregadas em receptores naturais, torna-se fundamental conhecer a presença e dispersão de integrões nestes ambientes, assim como a sua associação a outros elementos genéticos móveis e a genes de resistências a antibióticos. Neste trabalho, pretendeu-se avaliar a prevalência e diversidade de integrões em águas residuais de origem animal e doméstica, bem como a sua associação a plasmídeos conjugativos, usando metodologias dependentes e independentes do cultivo de microrganismos em laboratório. Os resultados obtidos sustentam assim a hipótese de que ambientes particularmente ricos em matéria orgânica, como é o caso das águas residuais, constituem ambientes propícios à presença de integrões e à ocorrência de transferência horizontal de genes de resistência a antibióticos, embora a sua prevalência e diversidade seja influenciada pelo tipo de efluente em questão. A presença de integrões em estações de tratamento de águas residuais, e em especial nos efluentes tratados, constitui assim um factor preocupante, uma vez que tal contribui para a sua disseminação e dispersão por outros ecossistemas aquáticos, nomeadamente rios e mares. Os métodos utilizados permitiram também detectar uma elevada diversidade de cassetes de genes associadas a integrões, sendo possível que algumas dessas sequências codifiquem para proteínas que desempenhem um importante papel na adaptação bacteriana às intensas pressões selectivas características deste tipo de ambientes. Assim, é possível concluir que as comunidades bacterianas presentes em águas residuais reúnem diferentes tipos de elementos geneticamente móveis que desempenham um importante papel não só na adaptação bacteriana, mas também na disseminação de determinantes genéticos de resistência para ambientes naturais. Adicionalmente, a presença de potenciais proteínas com possíveis aplicações biotecnológicas reforça a importância das águas residuais como fontes de diversidade funcional. Este trabalho incluiu também a criação e implementação da base de dados INTEGRALL, desenvolvida com o intuito de congregar informação acerca de integrões e de uniformizar a nomenclatura de cassetes de genes.

Evolution and functional relevance of Ataxin-3 paralogues

O gene ataxin-3 (ATXN3; 14q32.1) codifica uma proteína expressa ubiquamente, envolvida na via ubiquitina-proteassoma e na repressão da transcrição. Grande relevância tem sido dada ao gene ATXN3 após a identificação de uma expansão (CAG)n na sua região codificante, responsável pela ataxia mais comum em todo o mundo, SCA3 ou doença de Machado-Joseph (DMJ). A DMJ é uma doença neurodegenerativa, autossómica dominante, de início tardio. O tamanho do alelo expandido explica apenas uma parte do pleomorfismo da doença, evidenciando a importância do estudo de outros modificadores. Em doenças de poliglutaminas (poliQ), a toxicidade é causada por um ganho de função da proteína expandida; no entanto, a proteína normal parece ser, também, um dos agentes modificadores da patogénese. O gene ATXN3 possui dois parálogos humanos gerados por retrotransposição: ataxin-3 like (ATXN3L) no cromossoma X, e LOC100132280, ainda não caracterizado, no cromossoma 8. Estudos in vitro evidenciaram a capacidade da ATXN3L para clivar cadeias de ubiquitina, sendo o seu domínio proteolítico mais eficiente do que o domínio da ATXN3 parental. O objetivo deste estudo foi explorar a origem e a evolução das retrocópias ATXN3L e LOC100132280 (aqui denominadas ATXN3L1 e ATXN3L2), assim como testar a relevância funcional de ambas através de abordagens evolutivas e funcionais. Deste modo, para estudar a divergência evolutiva dos páralogos do gene ATXN3: 1) analisaram-se as suas filogenias e estimou-se a data de origem dos eventos de retrotransposição; 2) avaliaram-se as pressões seletivas a que têm sido sujeitos os três parálogos, ao longo da evolução dos primatas; e 3) explorou-se a evolução das repetições CAG, localizadas em três contextos genómicos diferentes, provavelmente sujeitos a diferentes pressões seletivas. Finalmente, para o retrogene que conserva uma open reading frame (ORF) intacta, ATXN3L1, analisou-se, in silico, a conservação dos locais e domínios proteicos da putativa proteína. Ademais, para este retrogene, foi estudado o padrão de expressão de mRNA, através da realização de PCR de Transcriptase Reversa, em 16 tecidos humanos. Os resultados obtidos sugerem que dois eventos independentes de retrotransposição estiveram na origem dos retrogenes ATXN3L1 e ATXN3L2, tendo o primeiro ocorrido há cerca de 63 milhões de anos (Ma) e o segundo após a divisão Platirrínios-Catarrínios, há cerca de 35 Ma. Adicionalmente, outras retrocópias foram encontradas em primatas e outros mamíferos, correspondendo, no entanto, a eventos mais recentes e independentes de retrotransposição. A abordagem evolutiva mostrou a existência de algumas constrições selectivas associadas à evolução do gene ATXN3L1, à semelhança do que acontece com ATXN3. Por outro lado, ATXN3L2 adquiriu codões stop prematuros que, muito provavelmente, o tornaram num pseudogene processado. Os resultados da análise de expressão mostraram que o gene ATXN3L1 é transcrito, pelo menos, em testículo humano; no entanto, a optimização final da amplificação específica dos transcriptos ATXN3L1 permitirá confirmar se a expressão se estende a outros tecidos. Relativamente ao mecanismo de mutação inerente à repetição CAG, os dois parálogos mostraram diferentes padrões de evolução: a retrocópia ATXN3L1 é altamente interrompida e pouco polimórfica, enquanto a ATXN3L2 apresenta tratos puros de (CAG)n em algumas espécies e tratos hexanucleotídicos de CGGCAG no homem e no chimpanzé. A recente aquisição da repetição CGGCAG pode ter resultado de uma mutação inicial de CAG para CGG, seguida de instabilidade que proporcionou a expansão dos hexanucleótidos.Estudos futuros poderão ser realizados no sentido de confirmar o padrão de expressão do gene ATXN3L1 e de detetar proteína endógena in vivo. Adicionalmente, a caracterização da proteina ataxina-3 like 1 e dos seus interatores moleculares poderá povidenciar informação acerca da sua relevância no estado normal e patológico.

Genetic profiling of ApoE in dementia

A demência é uma das principais causas de incapacidade entre os idosos, afetando mais de 36 milhões de pessoas em todo o mundo. É caracterizada pela deterioração progressiva das funções cognitivas, resultando em dificuldades no desempenho das atividades diárias do indivíduo. A idade de aparecimento dos sintomas, bem como a sua taxa de progressão, são variáveis entre a maior parte das demências, sendo estas geralmente caracterizadas por uma natureza progressiva, aumentando de gravidade ao longo do tempo. Entre os tipos mais frequentes de demência encontram-se a Doença de Alzheimer (DA), Demência Vascular, Demência de Corpos de Lewy e Demência Frontotemporal. O diagnóstico diferencial das demências é realizado tipicamente por testes neuro-psicológicos (para a exclusão de outras demências) e por exames imagiológicos. Contudo, muitos dos sintomas clínicos característicos podem sobrepor-se entre os diversos tipos de demência, o que pode constituir um problema devido a falta de especificidade e erros de diagnóstico. A compreensão dos fatores de risco ambientais e genéticos que podem modular o aparecimento e/ou progressão de doenças abre novas perspetivas relativamente à gestão destas neuropatologias. O gene da apolipoproteína E (ApoE) é reconhecido como o maior fator de risco na demência, desempenhando um papel central em particular no desenvolvimento da DA, sendo que os portadores do alelo ε4 são mais suscetíveis para a doença. Além disso, possíveis associações foram também propostas entre este gene e outras doenças neurológicas, sendo no entanto estes dados ainda controversos. Assim, o objetivo principal deste trabalho consistiu em determinar as frequências alélicas e genotípicas do gene ApoE num grupo de estudo piloto de pacientes com demência na região de Aveiro. Este grupo foi subdividido com base no diagnóstico neuroquímico, no qual foram avaliados os níveis de Aβ1-42, Tau-total e fosfo-Tau 181 no líquido cefalorraquidiano dos pacientes. Como resultado, observou-se que o alelo ε3 foi o mais frequente no grupo total, independentemente do tipo de patologia, e que o alelo ε2 foi o menos comum. O alelo ε4 foi de facto mais frequente em pacientes com DA do que em pacientes com outras neuropatologias, o que está de acordo com a relação proposta por outros autores. Adicionalmente, foi possível verificar que a frequência deste alelo nos pacientes com patologia amilóide é semelhante à observada no grupo DA, sugerindo um papel relevante para o ApoE no metabolismo e acumulação cerebral do Aβ. Consequentemente, estes indivíduos podem ter uma maior suscetibilidade para o desenvolvimento de DA no futuro. Deste modo, os nossos dados corroboram a ideia de que o alelo ε4 é um forte fator de risco para a DA e que deve ser considerado como um teste genético relevante que pode contribuir para o diagnóstico clínico da demência.

Molecular genomics of a genetic code alteration

The genetic code is not universal. Alterations to its standard form have been discovered in both prokaryotes and eukaryotes and demolished the dogma of an immutable code. For instance, several Candida species translate the standard leucine CUG codon as serine. In the case of the human pathogen Candida albicans, a serine tRNA (tRNACAGSer) incorporates in vivo 97% of serine and 3% of leucine in proteins at CUG sites. Such ambiguity is flexible and the level of leucine incorporation increases significantly in response to environmental stress. To elucidate the function of such ambiguity and clarify whether the identity of the CUG codon could be reverted from serine back to leucine, we have developed a forced evolution strategy to increase leucine incorporation at CUGs and a fluorescent reporter system to monitor such incorporation in vivo. Leucine misincorporation increased from 3% up to nearly 100%, reverting CUG identity from serine back to leucine. Growth assays showed that increasing leucine incorporation produced impressive arrays of phenotypes of high adaptive potential. In particular, strains with high levels of leucine misincorporation exhibited novel phenotypes and high level of tolerance to antifungals. Whole genome re-sequencing revealed that increasing levels of leucine incorporation were associated with accumulation of single nucleotide polymorphisms (SNPs) and loss of heterozygozity (LOH) in the higher misincorporating strains. SNPs accumulated preferentially in genes involved in cell adhesion, filamentous growth and biofilm formation, indicating that C. albicans uses its natural CUG ambiguity to increase genetic diversity in pathogenesis and drug resistance related processes. The overall data provided evidence for unantecipated flexibility of the C. albicans genetic code and highlighted new roles of codon ambiguity on the evolution of genetic and phenotypic diversity.

Aß biology and its contribution to Alzheimer's disease

A doença de Alzheimer (DA) é uma desordem neurodegenerativa progressiva patologicamente caracterizada pela presença de placas de amilóide (placas senis) insolúveis e também pela presença de tranças neurofibrilhares,formadas pela proteína Tau hiperfosforiladada. O principal constituinte das placas senis é o peptídeo beta-amilóide (Ab), que deriva do processamento proteolítico da proteína precursora de amilóide de Alzheimer (APP). Embora Ab exista como um agregado pouco solúvel nas placas senis, ele é secretado pelas células como uma molécula solúvel. O Ab “per se” pode afectar o metabolismo da APP. Alguns autores sugerem que o Ab exerce o seu efeito alterando o processamento ou catabolismo da APP, outros sugerem que ele também induz a transcrição da APP, onde aumentando os níveis da APP pode estar a contribuir para a sua própria produção (mecanismo de “feedback” positivo). Assim sendo, torna-se difícil consolidar todas estas observações e identificar as potenciais funções fisiológicas do Ab “in vivo”, ou as consequências da sua produção. Neste trabalho caracterizaram-se os efeitos do Ab no metabolismo da APP. Os nossos estudos revelaram que um dos mecanismos induzidos pelo Ab é a acumulação intracelular do fragmento neuroprotector sAPP (isAPPa) em estruturas com características vesiculares associadas ao citosqueleto. Estudos adicionais em culturas primárias revelaram que o Ab estava a exercer o seu efeito ao nível da secreção vesicular, provavelmente interferindo com o transporte de APP/sAPP ao longo da rede do citosqueleto. Esta hipótese é sustentada pelo facto do Ab estar a afectar a estabilidade e a polimerização de proteínas envolvidas na dinâmica do citosqueleto. Contrariamente a publicações anteriores o Ab não induziu a transcrição da APP, na verdade em culturas primárias neuronais foi observado uma diminuição nos níveis de expressão da APP. Isto foi acompanhado por um aumento nos fragmentos C-terminais da APP (CTFs) e uma diminuição na localização nuclear do seu domínio intracelular (AICD), sugerindo alterações na sinalização nuclear da APP. O Ab pode afectar outras vias de sinalização, particularmente alterando o balanço entre as actividades das proteínas cinases e fosfatases, o que pode ter consequências para o desenvolvimento da doença. Os dados obtidos indicam que o Ab é capaz de inibir a actividade da proteína fosfatase1, a sua importância numa perspectiva de futuras terapias é discutida. Devido à relevância da agregação do Ab para a sua toxicidade, a formação de complexos com proteínas que promovem a sua desagregação/degradação e o seu efeito no processamento da APP foi avaliado. Na presença destes complexos observou-se uma reversão da acumulação isAPP, demonstrando o potencial terapêutico destas proteínas como moduladores do metabolismo da APP. Este trabalho permitiu compreender melhor os mecanismos envolvidos nos efeitos do Ab no processamento da APP e descobrir algumas moléculas que podem ser relevantes numa perspectiva de diagnóstico e terapia na DA.

Chemokines impact in Alzheimer’s disease

Alzheimer’s Disease (AD) is a neurodegenerative disorder neuropathologically characterized by the presence of extracellular senile plaques, intracellular neurofibrillary tangles and synaptic loss. Neuroinflammation has been associated with some neurodegenerative diseases, such as AD. In AD, increased Aβ production and aggregation, have a fundamental role in the activation of the inflammatory process. In turn, this could be fundamental in the early stages of this pathology, regarding the Aβ clearance and brain protection. However, chronic inflammation leads to an increase of the inflammatory mediators, such as cytokines, released by activated microglia, astrocytes, and neurons. The excessive production of these inflammatory components promotes alterations in both amyloid precursor protein (APP) expression and processing, stimulating the increase of Aβ accumulation and abnormal tau phosphorylation. This results in neurotoxic effects, irreversible damage and neuronal loss. Chronic inflammation is a feature of AD however, little is known about the effects of some chemokines on its pathogenesis. Thus, the main aim of this thesis was to study the impact of the interleukin-8 (IL-8) and monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) on apoptosis, APP and tau. The both studied chemokines resulted in small alterations regarding the cytotoxicity on SH-SY5Y differentiated cells, being a significant increase in apoptosis observed only for the MCP-1 at the highest concentration. For the APP processing no significant differences were obtained, although a tendency to increase at different concentrations and periods was registered for both IL-8 and MCP-1. With respect to tau and other cytoskeleton-associated proteins, it was possible to observe a tendency to increase in the phosphorylated residue (Ser396) at the higher concentrations, as well as alterations on actin and tubulin with an increase on acetylated-α tubulin. This effect can be translated by neuronal architectural and survival alterations. Therefore additional studies could contribute to a better understanding of the way that these chemokines act on AD pathogenesis.

Molecular study of cell degeneration and evolution induced by mRNA mistranslation

As proteínas existentes nas células são produzidas pelo mecanismo de tradução do mRNA, no qual a informação genética contida nos genes é descodificada em cadeias polipeptídicas. O código genético, que define as regras de descodificação do genoma, minimiza os erros de tradução do mRNA, garantindo a síntese de proteínas com elevada fidelidade. Esta é essencial para a estabilidade do proteoma e para a manutenção e funcionamento dos processos celulares. Em condições fisiológicas normais, os erros da tradução do mRNA ocorrem com frequências que variam de 10-3 a 10-5 erros por codão descodificado. Situações que aumentam este erro basal geralmente estão associadas ao envelhecimento, stresse e a doenças; no entanto, em certos organismos o código genético é traduzido naturalmente com elevado erro, indicando que a síntese de proteínas aberrantes pode de algum modo ser vantajosa. A fim de estudar a resposta celular aos erros de tradução do mRNA, construímos leveduras que incorporam serina no proteoma em resposta a um codão de leucina, usando a expressão constitutiva de um tRNASer mutante. Este fenómeno genético artificial provocou uma forte diminuição da esporulação, da viabilidade e da eficiência de mating, afectando imensamente a reprodução sexual da levedura. Observou-se também uma grande heterogeneidade no tamanho e na forma das células e elevada instabilidade genómica, com o aparecimento de populações poliplóides e aneuplóides. No sentido de clarificar as bases celulares e moleculares daqueles fenótipos e compreender melhor a biologia do erro de tradução do mRNA, construímos também células de levedura que inserem serina em resposta a um codão de leucina de modo indutível e controlado. Utilizaram-se perfis de mRNA total e de mRNA associado a polissomas para elucidar a resposta celular ao erro de tradução do mRNA. Observou-se a indução de genes envolvidos na resposta ao stresse geral, stresse oxidativo e na unfolded protein response (UPR). Um aumento significativo de espécies reactivas de oxigénio (ROS) e um forte impacto negativo na capacidade das células pós-mitóticas re-iniciarem o crescimento foram também observados. Este fenótipo de perda de viabilidade celular foi resgatado por scavangers de ROS, indicando que o stresse oxidativo é a principal causa de morte celular causada pelos erros de tradução. Este estudo levanta a hipótese de que o stresse oxidativo e a acumulação de ROS, ao invés do colapso súbito do proteoma, são as principais causas da degeneração celular e das doenças humanas associadas aos erros de tradução do genoma. ABSTRACT: Proteins are synthesized through the mechanism of translation, which uses the genetic code to transform the nucleic acids based information of the genome into the amino acids based information of the proteome. The genetic code evolved in such a manner that translational errors are kept to a minimum and even when they occur their impact is minimized by similar chemical properties of the amino acids. Protein synthesis fidelity is essential for proteome stability and for functional maintenance of cellular processes. Indeed, under normal physiological conditions, mistranslation occurs at frequencies that range from 10-3 to 10-5 errors per codon decoded. Situations where this basal error frequency increases are usually associated to aging and disease. However, there are some organisms where genetic code errors occur naturally at high level, suggesting that mRNA mistranslation can somehow be beneficial. In order to study the cellular response to mRNA mistranslation, we have engineered single codon mistranslation in yeast cells, using constitutive expression of mutant tRNASer genes. These mistranslating strains inserted serines at leucine-CUG sites on a proteome wide scale due to competition between the wild type tRNALeu with the mutant tRNASer. Such mistranslation event decreased yeast sporulation, viability and mating efficiencies sharply and affected sexual reproduction strongly. High heterogeneity in cell size and shape and high instability in the genome were also observed, with the appearance of some polyploid or aneuploid cell populations. To further study the cellular and molecular basis of those phenotypes and the biology of mRNA mistranslation, we have also engineered inducible mRNA misreading in yeast and used total mRNA and polysome associated mRNA profiling to determine whether codon misreading affects gene expression. Induced mistranslation up-regulated genes involved in the general stress response, oxidative stress and in the unfolded protein response (UPR). A significant increase in reactive oxygen species (ROS) and a strong negative impact on the capacity of post-mitotic cells to re-initiate growth in fresh media were also observed. This cell viability phenotype was rescued by scavengers of ROS, indicating that oxidative stress is the main cause of cell death caused by mRNA mistranslation. This study provides strong support for the hypothesis that oxidative stress and ROS accumulation, rather than sudden proteome collapse or major proteome disruption, are the main cause of the cellular degeneration observed in human diseases associated mRNA mistranslation.

Molecular reconstruction of a genetic code alteration

The genetic code establishes the rules that govern gene translation into proteins. It was established more than 3.5 billion years ago and it is one of the most conserved features of life. Despite this, several alterations to the standard genetic code have been discovered in both prokaryotes and eukaryotes, namely in the fungal CTG clade where a unique seryl transfer RNA (tRNACAG Ser) decodes leucine CUG codons as serine. This tRNACAG Ser appeared 272±25 million years ago through insertion of an adenosine in the middle position of the anticodon of a tRNACGA Ser gene, which changed its anticodon from 5´-CGA-3´ to 5´-CAG-3´. This most dramatic genetic event restructured the proteome of the CTG clade species, but it is not yet clear how and why such deleterious genetic event was selected and became fixed in those fungal genomes. In this study we have attempted to shed new light on the evolution of this fungal genetic code alteration by reconstructing its evolutionary pathway in vivo in the yeast Saccharomyces cerevisiae. For this, we have expressed wild type and mutant versions of the C. albicans tRNACGA Ser gene into S. cerevisiae and evaluated the impact of the mutant tRNACGA Ser on fitness, tRNA stability, translation efficiency and aminoacylation kinetics. Our data demonstrate that these mutants are expressed and misincorporate Ser at CUGs, but their expression is repressed through an unknown molecular mechanism. We further demonstrate, using in vivo forced evolution methodologies, that the tRNACAG Ser can be easily inactivated through natural mutations that prevent its recognition by the seryl-tRNA synthetase. The overall data show that repression of expression of the mistranslating tRNACAG Ser played a critical role on the evolution of CUG reassignment from Leu to Ser. In order to better understand the evolution of natural genetic code alterations, we have also engineered partial reassignment of various codons in yeast. The data confirmed that genetic code ambiguity affects fitness, induces protein aggregation, interferes with the cell cycle and results in nuclear and morphologic alterations, genome instability and gene expression deregulation. Interestingly, it also generates phenotypic variability and phenotypes that confer growth advantages in certain environmental conditions. This study provides strong evidence for direct and critical roles of the environment on the evolution of genetic code alterations.

Molecular regulation of cork development: the QsMYB1 gene

Cork is a natural and renewable material obtained as a sustainable product from cork oak (Quercus suber L.) during the tree’s life. Cork formation is a secondary growth derived process resulting from the activity of cork cambium. However, despite its economic importance, only very limited knowledge is available about the molecular mechanisms underlying the regulation of cork biosynthesis and differentiation. The work of this PhD thesis was focused on the characterization of an R2R3-MYB transcription factor, the QsMYB1, previously identified as being putatively involved in the regulatory network of cork development. The first chapter introduces cork oak and secondary growth, with special emphasis on cork biosynthesis. Some findings concerning transcriptional regulation of secondary growth are also described. The MYB superfamily and the R2R3-MYB family (in particular) of transcription factors are introduced. Chapter II presents the complete QsMYB1 gene structure with the identification of two alternative splicing variants. Moreover, the results of QsMYB1 expression analysis, done by real-time PCR, in several organs and tissues of cork oak are also reported. Chapter III is dedicate to study the influence of abiotic stresses (drought and high temperature) and recovery on QsMYB1 expression levels. The effects of exogenous application of phytohormones on the expression profile of QsMYB1 gene are evaluated on Chapter IV. Chapter V describes the reverse genetic approach to obtain transgenic lines of Populus tremula L. x tremulóides Michx. overexpressing the QsMYB1 gene. Finally, in Chapter VI the final conclusions of this PhD thesis are presented and some future research directions are pointed based on the obtained results.

Caracterização da fosfatase String/Cdc25 como um regulador da neurotoxicidade de Tau em Drosophila

As tauopatias, grupo onde se inclui a doença de Alzheimer (AD), são caracterizadas pela deposição intracelular de emaranhados neurofibrilares (NFTs), compostos principalmente por formas hiperfosforiladas da proteína Tau, uma proteína que se associa aos microtúbulos. Os mecanismos moleculares subjacentes à neurotoxicidade induzida por Tau não são ainda claros. Drosophila melanogaster tem sido usada para modelar diversas doenças neurodegenerativas humanas, incluindo as tauopatias. Neste trabalho foi usado o sistema visual de Drosophila como modelo para identificar os passos que podem levar à acumulação de Tau em Tauopatias. Durante o desenvolvimento do olho de Drosophila, a expressão ectópica de hTau induz um olho rugoso, em consequência da neurotoxicidade, e que pode ser utilizado para identificar modificadores do fenótipo. A fosfatase codificada por string /cdc25 (stg), um regulador universal da transição G2/M, foi previamente identificada como um supressor da neurotoxicidade associada à expressão da proteina Tau. No entanto, os mecanismos moleculares que estão na base desta interação genética nunca foram estudados, desconhecendo-se também se a atividade fosfatase de Stg/Cdc25 é essencial para modular os níveis de fosforilação de Tau. O objetivo deste projeto consistiu em elucidar os mecanismos que se encontram na base da interação Stg-Tau. Para alcançar este objectivo, usou-se uma abordagem genética e bioquímica. Os resultados obtidos sugerem que Stg é um possível modulador da neurotoxicidade de Tau.

Revisiting molecular diagnostics of Streptococcus pneumoniae

Streptococcus pneumoniae is a human pathobiont that colonizes the nasopharynx. S. pneumoniae is responsible for causing non-invasive and invasive disease such as otitis, pneumonia, meningitis, and sepsis, being a leading cause of infectious diseases worldwide. Due to similarities with closely related species sharing the same niche, it may be a challenge to correctly distinguish S. pneumoniae from its relatives when using only non-culture based methods such as real time PCR (qPCR). In 2007, a molecular method targeting the major autolysin (lytA) of S. pneumoniae by a qPCR assay was proposed by Carvalho and collaborators to identify pneumococcus. Since then, this method has been widely used worldwide. In 2013, the gene encoding for the ABC iron transporter lipoprotein PiaA, was proposed by Trzcinzki and collaborators to be used in parallel with the lytA qPCR assay. However, the presence of lytA gene homologues has been described in closely related species such as S. pseudopneumoniae and S. mitis and the presence of piaA gene is not ubiquitous between S. pneumoniae. The hyaluronate lyase gene (hylA) has been described to be ubiquitous in S. pneumoniae. This gene has not been used so far as a target for the identification of S. pneumoniae. The aims of our study were to evaluate the specificity, sensitivity, positive predicted value (PPV) and negative predicted value (NPV) of the lytA and piaA qPCR methods; design and implement a new assay targeting the hylA gene and evaluate the same parameters above described; analyze the assays independently and the possible combinations to access what is the best approach using qPCR to identify S. pneumoniae. A total of 278 previously characterized strains were tested: 61 S. pseudopneumoniae, 37 Viridans group strains, 30 type strains from other streptococcal species and 150 S. pneumoniae strains. The collection included both carriage and disease isolates. By Mulilocus Sequence Analysis (MLSA) we confirmed that strains of S. pseudopneumoniae could be misidentified as S. pneumoniae when lytA qPCR assay is used. The results showed that as a single target, lytA had the best combination of specificity, sensitivity, PPV and NPV being, 98.5%, 100.0%, 98.7% and 100.0% respectively. The combination of targets with the best values of specificity, sensibility, PPV and NPV were lytA and piaA, with 100.0%, 93.3%, 97.9% and 92.6%, respectively. Nonetheless by MLSA we confirmed that strains of S. pseudopneumoniae could be misidentified as S. pneumoniae and some capsulated (23F, 6B and 11A) and non-capsulated S. pneumoniae were not Identified using this assay. The hylA gene as a single target had the lowest PPV. Nonetheless it was capable to correctly identify all S. pneumoniae.

From genes to radioresistance in head and neck squamous cell carcinoma

Head and Neck Cancers (HNC) are a group of tumours located in the upper aero-digestive tract. Head and Neck Squamous Cell Carcinoma (HNSCC) represent about 90% of all HNC cases. It has been considered the sixth most malignant tumour worldwide and, despite clinical and technological advances, the five-year survival rate has not improved much in the last years. Nowadays, HNSCC is well established as a heterogeneous disease and that its development is due to accumulation of genetic events. Apart from the majority of the patients being diagnosed in an advanced stage, HNSCC is also a disease with poor therapeutic outcome. One of the therapeutic approaches is radiotherapy. However, this approach has different drawbacks like the radioresistance acquired by some tumour cells, leading to a worse prognosis. A major knowledge in radiation biology is imperative to improve this type of treatment and avoid late toxicities, maintaining patient quality of life in the subsequent years after treatment. Then, identification of genetic markers associated to radiotherapy response in patients and possible alterations in cells after radiotherapy are essential steps towards an improved diagnosis, higher survival rate and a better life quality. Not much is known about the radiation effects on cells, so, the principal aim of this study was to contribute to a more extensive knowledge about radiation treatment in HNSCC. For this, two commercial cell lines, HSC-3 and BICR-10, were used and characterized resorting to karyotyping, aCGH and MS-MLPA. These cell lines were submitted to different doses of irradiation and the resulting genetic and methylation alterations were evaluated. Our results showed a great difference in radiation response between the two cell lines, allowing the conclusion that HSC-3 was much more radiosensitive than BICR-10. Bearing this in mind, analysis of cell death, cell cycle and DNA damages was performed to try to elucidate the motifs behind this difference. The characterization of both cell lines allowed the confirmation that HSC-3 was derived from a metastatic tumour and the hypothesis that BICR-10 was derived from a dysplasia. Furthermore, this pilot study enabled the suggestion of some genetic and epigenetic alterations that cells suffer after radiation treatment. Additionally, it also allowed the association of some genetic characteristics that could be related to the differences in radiation response observable in this two cell lines. Taken together all of our results contribute to a better understanding of radiation effects on HNSCC allowing one further step towards the prediction of patients’ outcome, better choice of treatment approaches and ultimately a better quality of life.